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超实用的DSP空间蛋白组分析内容解析

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发表于 2022.7.1 10:09:37 | 显示全部楼层 |阅读模式
在初步了解DSP空间蛋白组背景,技术原理、工作流程及实验设计思路后,想必大家对此技术也有了一定了解,DSP其实是一种多组学技术,既可以研究蛋白表达情况,也可以知道基因的调控状态(图1),当然也可以只进行蛋白或基因的研究,称为DSP空间蛋白与DSP空间转录组。

图1 DSP空间多组学图示

今天主要给大家介绍下DSP空间蛋白组结论的核心支撑部分--数据分析。基于一份数据表,能进行什么分析研究、用什么图形、揭示怎样的生物学问题,这也是大家比较关心的层面。毕竟合理的数据处理,才揭示客观真理的最有效途径!

在进行分析内容的介绍之前,先简单的回顾下DSP空间蛋白的整体分析流程,有助于对后续分析内容的理解。DSP工作流程概括为以下5部分(图2):

染色&孵育(通过荧光染料和蛋白抗体对切片进行染色和孵育)--②区域挑选(基于①形态学染色结果,圈选目标区域(AOI)--③光裂解(释放蛋白抗体上连接的寡核苷酸标签序列)-- ④标签收集(收集释放的寡核苷酸标签序列)--⑤定量/定性(基于nCounter或NGS进行定量/定性)。

图2 DSP工作流程

从上述工作流程,可以看出,DSP技术与以往传统蛋白质组技术(关注组织或细胞裂解液中的蛋白表达水平)有极大的不同,主要体现在三方面:
1)DSP可实现定位研究:在切片原位基于形态学marker染色结果,靶向检测目标区域(AOI)的蛋白表达;
2)最大化保留空间信息:在目标组织区域原位检测蛋白表达;
3)“局部放大”的全新视角:相较于单细胞的全片检测,DSP基于区域圈选,可放大局部特征,特别适合肿瘤,免疫以及微环境的相关生物机制探索。

那DSP空间蛋白的分析内容都有哪些呢?大体上可以分为空间定位,定性/定量分析、然后把定性/定量后的蛋白丰度数据,通过热图进行可视化(绘制全局蛋白表达谱)、之后是样本相关性分析、最后通过定制化的差异分析,定位造成分组差异的关键蛋白分子。各分析点之间有逻辑上的分级(图3),层层递进全面揭示表型差异的分子机制。

下面对各分析点进行详细的介绍:

图3 dsp空间蛋白的分析内容概述

一、如何实现空间定位研究

“定位”也就是常说的“空间靶向性”研究,是整篇文章的核心部分,贯穿了整个分析内容,那如何实现定位呢?

1. 在进行实验之前,通过阅读大量的相关领域的文献,基本上已经确定了要研究的组织部位,例如,神经疾病研究,可能取大脑组织的海马区,额叶皮层等等,这些组织会先制备成石蜡切片进行保存;

2. 接下来准备DSP样本,首先通过传统免疫组化的方法将石蜡切片进行脱蜡/水合/抗原修复处理;

3. 之后就是很重要的染色&孵育步骤。染色和孵育从原理上来说是两部分的内容,但两者并不存在干扰,因此可以合并成一步进行。先选取合适的荧光染料(特异性抗体、生物染色剂)与切片组织特异性结合(一般可在切片上预染1-4个荧光抗体,多重染色),用以区分组织切片的形态学特征,为寻找目标区域做准备,因此荧光染料又被称为形态学marker。之后与多重蛋白抗体(寡核苷酸和光可切割链接子修饰的靶点特异性抗体,图4)进行孵育,实现组织的原位结合。

图4 多重蛋白抗体结构

4. 基于形态学染色结果(不同的组织形态或细胞类型呈现不同的颜色,图5),人为圈选目标区域(AOI/ROI)进行后续的定性/定量,相关性分析、差异分析等。由于这些分析内容都是基于圈选的区域进行的,至此,就实现“空间定位”研究。

图5 基于组织形态特征区域(ROI/AOI)圈选

前面实现了空间区域的定位,那接下来就深入到分子水平揭示分组/样本的蛋白表达差异,这些差异往往是驱动空间异质性、疾病状态的根本原因。

二、定量/定性分析

2.1 组织切片全景图

像大多文章,首先会先展示一张组织切片的全景图(图6),这张图是DSP的荧光数据影像结果,从这张图上能知道所圈选的区域(AOI)的位置以及名称,这个名称一般是序号+形态学特征进行命名,比如你圈选的是皮肤癌组织,就会命名为00x Tumor,并且这个名称会在后续的分析中沿用,通俗来讲这张图就相当于普通测序采样信息,对讲好故事有很大逻辑上的帮助。

图6 切片全景图

2.2 nCounter表达定量

接下来就是定性定量的内容了,这部分一般不会出现在文章的表述里,主要作用是获得后续绘制蛋白全谱,样本分析,差异鉴定赖于分析的蛋白丰度表,因此也简单的过一下。在前期有提到,DSP可以基于nCounter或NGS进行定量/定性分析,由于在DSP空间蛋白中可检测的蛋白靶标(panel)比较少(<100),通常使用nCounter即可满足定量需求。nCounter是根据碱基互补配对原理进行定量的,即四色荧光基团排列组合表征不同的oligo序列,而oligo序列与靶标蛋白一一对应,把oligo探针收集后,比对探针库就可以知道是哪种蛋白,从而实现蛋白的定性定量(图7)。

图7 nCounter定量原理图

2.3 表达量归一化

后续还需要对表达量进行归一化处理,防止不同样本间数据波动过大(两个样本一个丰度为1000,一个丰度为10)。在DSP空间蛋白中归一化策略主要有两种方式,即管家基因归一化和背景基因归一化,1)管家/背景基因QC:观察管家/背景基因两两之间在各AOI 中表达量的相关性,去除相关性低的基因(图8);2)以相关性高的管家/背景基因为基准,计算AOI归一化因子,蛋白最终的表达量为原始表达量乘以归一化因子(图9)。

*注:归一化因子=所有AOI上管家/背景基因的几何平均数与特定AOI中管家/背景基因的几何平均数之比。

图8 管家基因归一化结果

图9 背景基因归一化结果

2.4 绘制全局图谱

经过上述定量、归一化后,就能得到比较准确的蛋白表达量表,这张表格可能包含几十上百的蛋白丰度数据,没法让读者一眼捕捉到关键信息,即在不同的ROI/AOI区域中,哪种蛋白高丰度,哪种低丰度,因此需要绘制一张全局的蛋白图谱(图10),来直观的展示不同圈选区域的蛋白分布情况。通常横坐标放置样本(患者)圈选的ROI/AOI区域,像此图中CD45指示免疫区域、PanCK指示肿瘤区域、CAF指示成纤维细胞区域;纵坐标表示的就是蛋白,通过这样的一张热图,就可以查看蛋白在各ROI/AOI中的整体表达分布情况。

*注:在前期抗体孵育的时候,检测的蛋白已经按照功能panel设计好了,因此这里检测的并不是区域中所有的蛋白,而是根据你的panel的选择。比如想研究阿尔茨海默症,我们就要选择Alzheimer’s Disease Pathology*这种panel,那与这个疾病相关的蛋白就会被检测出来,如图11,相应的蛋白组panel信息我们也给大家汇总好了,另外每个panel里面所包含的具体抗体信息,大家可以登录官网去查询。(网址:https://nanostring.com/

图10 全局蛋白图谱

图11 蛋白组panel信息汇总

三、样本相关性分析


在初步了解蛋白的分布情况后,接下来可以进行样本相关性分析,在样本相关性分析中一般有两种思路,第一种是基于靶蛋白在各ROI/AOI中的表达谱进行相关性分析(图12),也就是想研究圈选的不同ROI/AOI区域之间的相关性;第二种是解析ROI/AOI表型与靶蛋白表达之间的相关性,这种比较好理解,是蛋白与蛋白互作关系的探究(图13)。这两种典型的思路在文章中都有涉及,任选其一进行表述或者同时展示都可。

图12 ROI/AOI间相关性分析


图13 靶蛋白间相关性分析


四、差异分析


最后就是差异分析部分,这部分属于必做的分析内容,可以少了样本相关性研究,蛋白表达谱的绘制,但差异分析是必须要有的。我们做研究的目的,就是解析造成表型差异的分子机制,而在组学研究中是通过差异分析来实现的。所谓差异分析,就是通过各种统计检验计算组间或组内,某个或某类关键的因子,细胞等是否有差异。比如在癌症患者和健康对照组中,检测到癌症患者中某种蛋白丰度很高,而健康对照中极低或者根本就不存在,然后通过统计检验,也发现这个蛋白在两组中的分布确实是有显著性的差异,暗示,此蛋白可能是导致癌症发生的关键因素,那整篇文章的逻辑就完整了。

相应的差异分析也有两种典型的思路,其一是进行样本内差异分析[1],这个主要是探究同一组织切片不同区域,蛋白表达的异质性(图14)。第二种样本间的差异分析,这个主要目的是探究组织切片间蛋白表达异质性,多用于挖掘新的生物标志物、疾病发病新机制、新的治疗靶点、肿瘤分型等。例如图15,作者就是通过对不同表型间(NP和PD)的患者蛋白表达进行差异分析,鉴定到与疾病进展有关的差异蛋白,进而解释表型差异的分子机制[2]

图14样本内差异分析

图15 样本间差异分析

总结:

DSP空间蛋白的分析点与传统转录组(定性/定量、差异、富集、梯度分析、WGNCS等等)相比,可以说是极其简单的,那为什么通过如此简单的分析思路,发出的文章几乎都是顶刊呢?因为DSP的出现,弥补了“空间定位“的空白,在此以前,没有任何一项技术可以做到此点,也正是印证了那句分析点“不在于多,而在于精”。DSP技术的”精“就是”空间定位“的能力,可为癌症,神经性疾病等寻找新的药物靶点,带来了极大可能。

参考文献

[1]Lu, Yue, et al. "Resolution of tissue signatures of therapy response in patients with recurrent GBM treated with neoadjuvant anti-PD1." Nature communications 12.1 (2021): 1-13. https://doi.org/10.1038/s41467-021-24293-4
[2]Kulasinghe, Arutha, et al. "Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients." Frontiers in oncology (2021): 3118. doi: 10.3389/fonc.2020.607349




本文作者:基迪奥-潇潇

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